JPhys Photonics编辑优选:圆扫描FCS实现稀疏和异质体系分子动力学测量
本篇研究来自西安电子科技大学郜鹏、西安交通大学姚翠萍课题组。本文提出面向稀疏和异质性样品分子动态测量的圆扫描荧光相关光谱(CS-FCS)技术。CS-FCS通过高速圆扫描方式采集荧光涨落数据,有效克服了传统线扫描的机械惯性,并将时间分辨率提升至0.1 ms(较线扫描提高5~10倍),同时使有效观测覆盖区域增大6倍。在数据分析中,全局自相关分析能够提高对稀疏样品的测量效率;逐像素自相关分析可获取不同空间位置样品的动力学差异。该方法在空间异质纳米颗粒、稀疏生物颗粒等多体系中的应用验证了测量的可行性和准确性。此外,还在活细胞内实现了多个细胞器膜上的大分子动力学的实时测量。 文章介绍 Circular scanning fluorescence correlation spectroscopy (CS-FCS) for probing molecular dynamics of sparse or heterogeneous samples Lan Yu(于岚), Xiaoman Dong(董小曼), Weihui Zeng(曾维慧), Cuiping Yao(姚翠萍) and Peng Gao(郜鹏) 通讯作者: 郜鹏,西安电子科技大学物理学院 姚翠萍,西安交通大学生命科学与技术学院, 研究背景: 生物大分子在细胞内的扩散、运输与相互作用是生命活动的基础,定量测量其动力学参数(如扩散系数)对于理解信号转导、代谢调控及疾病机制至关重要。荧光相关光谱(FCS)作为一种高灵敏度的分子动力学测量技术,通过探测荧光强度涨落并利用自相关分析定量获取目标分子的动力学参数,已成为生命科学研究的重要工具。然而,将FCS应用于活细胞内大分子测量面临两大挑战:其一,细胞是高度空间异质的体系,线粒体、内质网、质膜等不同空间区域的分子动力学呈现显著异质性,传统单点FCS无法同时获取不同空间位置的异质信息;其二,细胞内生物大分子常呈稀疏分布,而传统单点FCS有效观测体积仅约0.5 fL,难以对低浓度分子进行采样以获得可靠的自相关曲线。现有扫描FCS技术虽能扩展空间覆盖范围,但时间分辨率仅为毫秒级,且传统线扫描方式存在回程时间误差,难以准确捕捉亚毫秒尺度的快速扩散过程。因此,亟需发展一种兼具高时间分辨率、大观测体积和空间分辨能力的FCS测量方法,以满足细胞内稀疏和异质体系中分子动力学的高效准确测量需求。 研究内容: 本文提出圆扫描荧光相关光谱(CS-FCS)方法,通过高速圆扫描模式采集荧光涨落数据,并将时间分辨率提升至0.1 ms,较线扫描FCS提高5~10倍;其空间测量范围相较于单点FCS增大6倍。该方法采用全局与逐像素自相关分析,全局自相关适用于低浓度稀疏样品;逐像素自相关分析可获取不同亚细胞位置的异质动力学信息,无需多次测量即可同时量化多区域分子扩散行为。CS-FCS在保留单分子测量灵敏度的同时,兼具高时间分辨率、大观测体积和空间分辨能力,为复杂生物体系的动态测量提供了一种高效工具。 图1 CS-FCS 原理示意图 利用CS-FCS对水中荧光纳米颗粒的进行了测量,全局自相关分析表明直径为40 nm和100 nm颗粒的扩散系数分别为11.1 ± 0.8 μm²/s和6.4 ± 0.4 μm²/s,如图2所示,与单点FCS和线扫描FCS的测量结果一致,验证了CS-FCS方法的测量准确性。 图2 CS-FCS技术测量荧光纳米微球在PBS中的扩散系数 图3展示了CS-FCS与单点FCS在测量稀疏纳米颗粒上的对比,相同测量时间内,单点FCS的焦点不能有效触及待测微粒,无法获得可靠的自相关曲线。然而,CS-FCS因观测体积增大,可采集足够有效信号从而准确获取扩散系数,证明了其在稀疏样品测量中的优势。…